zabika.ru 1

Ф КГМУ 4/3-04/01

ИП №6 УМС при КазГМА


от 14 июня 2007 г.

Карагандинский государственный медицинский университет

Кафедра фармацевтических дисциплин с курсом химии


ЛЕКЦИЯ
Тема: Основы культивирования клеток микроорганизмов, растений, животных с целью наработки биомассы .

Элективная дисциплина: Основы биотехнологии
Специальность: 051103 - фармация

Курс _4

Время (продолжительность) _1ч



Караганда 2011 г.

Утверждено на заседании кафедры

23.09.2011 Протокол № 2


Заведующий кафедрой, доц. ________________ Лосева И.В.
Тема: Основы культивирования клеток микроорганизмов, растений, животных с целью наработки биомассы.

Цель: Ознакомить с принципами культивирования клеток для получения клеточной биомассы, используемой в различных биопроизводствах

План лекции:

  1. Культивирование клеток животных, растений, микроорганизмов с целью наработки биомассы.

  2. Вакцины. История вакцинологии.

  3. Классификация вакцин, виды вакцин.

  4. Производство живых и убитых корпускулярных вакцин.


Под общим названием вакцин объединяют все препараты, получаемые как из самих патогенных микроорганизмов или их компонентов, так и продуктов их жизнедеятельности, которые применяются для создания активного иммунитета у животных и людей.

Историю создания средств специфической профилактики можно разделить на три периода:

1. Бессознательные попытки на заре научной медицины искусственно заражать здоровых людей и животных выделениями от
больных с легкой формой заболевания.

2. Создание большого количества вакцин из убитых бактерий.

3. Создание и применение живых, убитых, субъединичных вакцин.

Первый период ознаменовался гениальным открытием живых вакцин Э. Дженнером (1796) и Л. Пастером (1880). Хотя в основе этих открытий лежали опыт и наблюдения (Э. Дженнер), знание этиологии и сознательный эксперимент (Пастер), главным в этот почти столетний период было искусственное заражение с последующим переболеванием, то есть вызвать «легкую болезнь» с тем, чтобы человек не заболел ею в тяжелой смертельной форме. Вакцина Дженнер а против оспы, вакцины Пастера против холеры кур (1880), сибирской язвы (1880–1883), рожи свиней (1882–1883), бешенства (1-S81–1886) содержали живых возбудителей болезни, ослабленных различными методами: возбудитель холеры кур – длительным хранением культур в бульоне, воздействием на возбудителя сибирской язвы повышенной температурой (42,5 °С), пассажем возбудителя рожи через организм голубей и кроликов, пассированием вируса бешенства через организм кроликов.


В 1884 году Л.С. Ценковский в России, используя принцип аттенуации (ослабления) по Пастеру, приготовил свои вакцины против сибирской язвы. В 1908 году Wall и Leclainche получили вакцину против эмкара из культур возбудителя, выращенных при 43–44° С, или культуры, выращенные в средах со специфической сывороткой. Затем подобные живые вакцины были получены против холеры людей (Хавкин В., в Индии, 1890–1896; Nikole, 1912). В 1897 году Р. Кох в практику профилактических прививок против чумы крупного рогатого скота предложил живой вирус из желчи убитых, больных или павших от чумы животных. Эти прививки давали отход до 30%. Вскоре Ненцкий, Забер и Выжникевич заменили их «симультанными» прививками, то есть одновременным введением с живым вирусом специфической сыворотки.

На этом первый, самый ранний период разработки живых вакцин заканчивается, вместе с ним заканчивается и первый период развития иммунологии.

Второй период характеризуется изготовлением вакцин из убитых бактерий и открытием большого количества возбудителей заболеваний. И смело можно сказать, что не было такого микроорганизма, который бы в убитом состоянии не использовался в качестве вакцины. Официальным началом этого периода следует считать 1898 год (Kolle Pieiffer), он дал богатые плоды для медицины и ветеринарии в создании так называемых корпускулярных вакцин. В то же время он принес науке много удивительных открытий и разочарований. Этот период не закончен и сейчас, так как из-за отсутствия эффективных профилактических препаратов мы пользуемся убитыми корпускулярными вакцинами при целом ряде инфекций, хотя имеются совершеннейшие методы аттенуации микроорганизмов.

В разработке живых вакцин этот период сыграл печальную роль. Он задержал их развитие более чем на 20 лет. Но в то же время в этот период бытовало мнение о недостаточной эффективности убитых вакцин. Ученые не оставляли поисков все новых и новых живых вакцин, как наиболее эффективных и экономичных профилактических препаратов.


В третий период (с 1930 года) в равной мере получили развитие живые, убитые и так называемые химические вакцины из очищенных антигенов, то есть третий период характеризуется развитием обоих направлений.

Сторонники применения убитых вакцин, ссылаясь на факты осложнений при применении живых вакцин в ветеринарной практике, отвергали их и стремились усовершенствовать убитые вакцины. Способы улучшения убитых вакцин были связаны с применением различных физических и химических агентов для обезвреживания микробов, подбором штаммов с полноценными антигенами, введение «щадящих» режимов инактивации культур микробов, использованием очищенных, так называемых протективных, антигенов (химических вакцин). Уделялось немало работ вопросам «депонирования» убитых и химических вакцин, методам их аппликации, кратностям, интервалам, дозам введения, а также проблеме ревакцинаций. При этом были достигнуты большие успехи. Но все же проблема ликвидации инфекционных болезней успешно не решалась.

Изготовление живых вакцин в 20–60-х годах текущего века не стояло на месте. Разработки получения живых вакцин проводились, no несколько более замедленными темпами, чем убитых вакцин. Лишь в последние 20–30 лет мы становимся свидетелями широкого производства живых вакцин и замены ими убитых вакцин, не всегда являющихся эффективными.

Например, многолетний опыт использования убитых вакцин в нашей стране и за рубежом при профилактике сальмонеллезов показал их недостаточную иммуногенную эффективность, так как сальмонеллезные антигены в организме привитых животных не способны размножаться. Это ограничивает их циркуляцию в организме и проявление клеточного иммунитета. Последнее заставляет применять убитые вакцины многократно, вводить их большими дозами, что обуславливает высокую реактогенность убитых вакцин. Для профилактики инфекционных болезней более эффективными считают живые вакцины их аттенуированных штаммов. Последние получают при пассировании вирулентных культур микроорганизмов на искусственных питательных средах и через невосприимчивых животных, а также воздействием на них физических, химических и биологических факторов. Введение таких штаммов в организм обеспечивает их размножение не вызывая заболевания. 1 аоборот, они обеспечивают выработку более прочного, в том числе клеточного, иммунитета. В отличие от иммунитета, сформировавшегося под действием убитых вакцин, иммунитет от применения живых вакцин наступает более быстро, уже после однократного введения вакцины. Он более напряженный и продолжительный. Однако преимущества живых вакцин перед убитыми этим не исчерпываются.


Согласно современным международным требованиям штаммы, применяемые для изготовления живых вакцин, должны иметь генетические маркеры, позволяющие отличить их от полевых штаммов. Они должны обладать постоянством (константность) своих биологических свойств, слабой остаточной вирулентностью и обеспечивать невосприимчивость к инфекции большинства животных при однократном применении вакцины.

Значение живых вакцин оценивается еще и с экономических позиций. На Международном конгрессе микробиологов в 1966 году было высказано мнение, что применение живых вакцин обеспечивает сохранение экологического баланса, не допускающее появление новых патогенных микроорганизмов.

Большинство выпускаемых у нас живых вакцин в настоящее время являются моноштаммными. Технология их изготовления не учитывает многообразия серовариантного состава бактерий.

В технологическом процессе вакцинного производства важны все звенья: от подбора производственных штаммов и питательной среды до конечных этапов – стандартизации и расфасовки биопрепаратов.

Технологическая схема изготовления инактивированных (I) и живых (II) вакцин на примере производства вакцин против сальмонеллеза.

Мы уже ознакомились с биотехнологией приготовления питательных сред, подбором производственных штаммов микроорганизмов и технологией культивирования их в промышленных условиях. Для производства вакцин важен метод глубинного культивирования микроорганизмов в реакторах, в которых должен предусматриваться автоматический контроль и регулирование следующих технологических параметров: температуры (t), давления (Р), расхода воздуха (G), уровня среды (Н), концентрации микроорганизмов (М), концентрации микроэлементов (Г), числа оборотов перемешивающего устройства (п), концентрации водородных ионов (рН), парциального давления кислорода (рО2) и углекислого газа (рСО2), концентрации углеводов (в частности глюкозы), окислительно-восстановительного потенциала (Eh). При этом нужно иметь в виду, что для каждого микроорганизма нужна индивидуальная питательная среда и свои параметры культивирования.


Полученную после выращивания микробов культуру используют в зависимости от вида приготовляемой вакцины – инактивированной или живой.
В качестве антигенов при конструировании В. используют: живые ослабленные (аттенуированные) микроорганизмы; неживые (инактивированные, убитые) цельные микробные клетки или вирусные частицы; извлеченные из микроорганизмов сложные антигенные структуры (протективные антигены); продукты жизнедеятельности микроорганизмов – вторичные метаболиты (например, токсины, молекулярные протективные антигены): антигены, полученные путем химического синтеза или биосинтеза с применением методов генетической инженерии.

В соответствии с природой специфического антигена В. делят на живые, неживые и комбинированные (как живые, так и неживые микроорганизмы и их отдельные антигены). Живые В. получают из дивергентных (естественных) штаммов микроорганизмов, обладающих ослабленной вирулентностью для человека, но содержащих полноценный набор антигенов (например, вирус коровьей оспы), и из искусственных (аттенуированных) штаммов микроорганизмов. К живым В. можно отнести также векторные В., полученные генно-инженерным способом и представляющие собой вакцинный штамм, несущий ген чужеродного антигена (например, вирус оспенной вакцины со встроенным антигеном вируса гепатита В).

Неживые В. подразделяют на молекулярные (химические) и корпускулярные. Молекулярные В. конструируют на основе специфических протективных антигенов, находящихся в молекулярном виде и полученных путем биосинтеза или химического синтеза. К этим В. можно отнести также анатоксины, которые представляют собой обезвреженные формалином молекулы токсинов, образуемых микробной клеткой (дифтерийный, столбнячный, ботулинический и др.). Корпускулярные В. получают из цельных микроорганизмов, инактивированных физическими (тепло, ультрафиолетовое и другие излучения) или химическими (фенол, спирт) методами (корпускулярные, вирусные и бактериальные вакцины), или из субклеточных над-молекулярных антигенных структур, извлеченных из микроорганизмов (субвирионные вакцины, сплит-вакцины, вакцины из сложных антигенных комплексов).


Молекулярные антигены, или сложные протективные антигены бактерий и вирусов, используют для получения синтетических и полусинтетических вакцин, представляющих собой комплекс из специфического антигена, полимерного носителя и адъюванта. Из отдельных В. (моновакцин), предназначенных для иммунизации против одной инфекции, готовят сложные препараты, состоящие из нескольких моновакцин. Такие ассоциированные вакцины, или поливакцины, поливалентные вакцины обеспечивают иммунитет одновременно против нескольких инфекций. Примером может служить ассоциированная АКДС-вакцина, в состав которой входят адсорбированные дифтерийный и столбнячный анатоксины и коклюшный корпускулярный антиген. Существует также семейство полианатоксинов: ботулинический пентаанатоксин, противогангренозный тетраанатоксин, дифтерийно-столбнячный дианатоксин. Для профилактики полиомиелита применяют единый поливалентный препарат, состоящий из аттенуироваиных штаммов I, II, III серотипов (сероваров) вируса полиомиелита.

Наиболее просты в изготовлении живые В., так как технология в основном сводится к выращиванию аттенуированного вакцинного штамма с соблюдением условий, обеспечивающих получение чистых культур штамма, исключение возможностей загрязнения другими микроорганизмами (микоплазы, онковирусы) с последующей стабилизацией и стандартизацией конечного препарата. Вакцинные штаммы бактерий выращивают на жидких питательных средах (гидролизаты казеина или другие белково-углеводные среды) в аппаратах – ферментаторах емкостью от 0,1 м3 до 1–2 м3. Полученная чистая культура вакцинного штамма подвергается лиофильному высушиванию с добавлением протекторов. Вирусные и риккетсиозные живые В. получают выращиванием вакцинного штамма в эмбрионах кур или перепелов, свободных от вирусов лейкоза, либо в культурах клеток, лишенных микоплазм. Используют или первично-трипсинизированные клетки животных или перевиваемые диплоидные клетки человека. Живые аттенуированные штаммы бактерий и вирусов, применяемые для приготовления живых В., получены, как правило, из природных штаммов путем их селекции или пассажей через биологические системы (организм животных, эмбрионы кур, культуры клеток, питательные среды).


В связи с успехами генетики и генетической инженерии появились возможности целенаправленного конструирования вакцинных штаммов. Получены рекомбинантные штаммы вируса гриппа, а также штаммы вируса вакцины со встроенными генами протективных антигенов вируса гепатита В. Инактивированные корпускулярные бактериальные В. или цельновирионные инактивированные В. получают соответственно из культур бактерий и вирусов, выращенных на тех же средах накопления, что и в случаях получения живых вакцин, и затем подвергнутых инактивации нагреванием (гретые вакцины), формалином (формолвакцины), ультрафиолетовым излучением (УФ-вакцины), ионизирующим излучением (радиовакцины), спиртом (спиртовые вакцины). Инактивированные В. ввиду недостаточно высокой иммуногенности и повышенной реактогенности не нашли широкого применения.

Производство молекулярных В. – более сложный технологический процесс, т. к. требует извлечения из выращенной микробной массы протективных антигенов или антигенных комплексов, очистки и концентрирования антигенов, введения в препараты адъювантов. Выделение и очистка антигенов с помощью традиционных методов (экстракции трихлоруксусной кислотой, кислотного или щелочного гидролиза, ферментативного гидролиза, высаливания нейтральными солями, осаждения спиртом или ацетоном) сочетаются с применением современных методов (скоростного ультрацентрифугирования, мембранной ультрафильтрации, хроматографического разделения, аффинной хроматографии, в т.ч. на моноклональных антителах). С помощью этих приемов удается получать антигены высокой степени очистки и концентрирования. К очищенным антигенам, стандартизированным по числу антигенных единиц, с целью повышения иммуногенности добавляют адъюванты, чаще всего сорбенты-гели (гидрат окиси алюминия и др.). Препараты, в которых антиген находится в сорбированном состоянии, называют сорбированными или адсорбированными (дифтерийный, столбнячный, ботулинический сорбированные анатоксины). Сорбент играет роль носителя и адъюванта. В качестве носителя в синтетических вакцинах предложены всевозможные полимеры.


Интенсивно разрабатывается генно-инженерный способ получения протективных белковых антигенов бактерий и вирусов. В качестве продуцентов используют обычно эшерихии, дрожжи, псевдомонады со встроенными в них генами протективных антигенов. Получены рекомбинантные штаммы бактерий, продуцирующие антигены возбудителей гриппа, коклюша, кори, герпеса, гепатита В, бешенства, ящура, ВИЧ-инфекции и др. Получение протективных антигенов генно-инженерным способом целесообразно в том случае, когда выращивание микробов связано с большими трудностями или опасностями, или когда трудно извлекать антиген из микробной клетки. Принцип и технология получения В. на основе генно-инженерного способа сводятся к выращиванию рекомбинантного штамма, выделению и очистке протективного антигена, конструированию конечного препарата.



    • Иллюстративный материал: схемы биотехнологических производств на слайдах-презентациях

    • Литература

  1. Основы фармацевтической биотехнологии: Учеб. пос. для медвузов /Т.П.Прищеп, В.С.Чучалин, К.Л.Зайков и др.-Ростов н/Д;Томск: Феникс; СГМУ, 2006.-252с.

  2. К.Х. Алмагамбетов. Биотехнология микроорганизмов. Астана, Евраз. нац. университет им. Л.Гумилева – 2008. – 238с.

  3. К.Х.Алмагамбетов. Основы биотехнологии. – Астана. – 2006. – 198с.

  4. Егорова Т.А., Клунова С.М., Живухина Е.А. Основы биотехнологии, - М: АСАDЕМА, - 2003г. – 207с.

  5. Елинов Н.П. Основы биотехнологии. – Спб., 1995г.

  6. Избранные вопросы медицинской биотехнологии. Избранные вопросы медицинской биотехнологии. – Сиб.ГМУ, Томск – 2004. – 135с.

  7. Р.Реннеберг,И.Реннеберг."От пекарни до биофабрики".М:Мир, 1991 г.




    • Контрольные вопросы (обратная связь):

1) Для получения каких препаратов используют культивирование клеток с целью накопления биомассы?

2) Что такое вакцины?

3) Какие виды вакцин вам известны?

4) Основные этапы приготовления вакцин.